免疫親和柱是一種基于抗原-抗體特異性結(jié)合原理的高效分離和純化工具，在生物樣品分析、藥物檢測(cè)、食品安全等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
一、工作原理
核心是利用抗原與抗體之間的高度特異性結(jié)合反應(yīng)。其基本組成包括固相載體和與之偶聯(lián)的特異性抗體。當(dāng)含有目標(biāo)抗原的樣品溶液通過柱時(shí)，目標(biāo)抗原會(huì)與固定在固相載體上的抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物。而其他非特異性物質(zhì)則會(huì)隨著流動(dòng)相流出柱子，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)抗原的選擇性富集和分離。
這種特異性結(jié)合具有高度的親和力和專一性，即使在復(fù)雜的樣品基質(zhì)中，也能準(zhǔn)確地捕獲目標(biāo)抗原。同時(shí)，還可以通過洗脫操作，將結(jié)合在抗體上的目標(biāo)抗原洗脫下來，得到純凈的目標(biāo)抗原用于后續(xù)的分析檢測(cè)。
二、操作流程
?。ㄒ唬?zhǔn)備工作
?選擇合適的免疫親和柱：根據(jù)目標(biāo)抗原的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)要求，選擇相應(yīng)規(guī)格和特異性的柱。確保柱的質(zhì)量和性能符合實(shí)驗(yàn)需求。
?樣品預(yù)處理：對(duì)待檢測(cè)的樣品進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理，以去除雜質(zhì)和大顆粒物質(zhì)，防止堵塞。同時(shí)，根據(jù)樣品的性質(zhì)和目標(biāo)抗原的特點(diǎn)，可能需要對(duì)樣品進(jìn)行稀釋或濃縮處理，以保證目標(biāo)抗原的濃度在合適的范圍內(nèi)。
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?連接裝置：將柱與液相色譜系統(tǒng)或蠕動(dòng)泵等裝置連接好，確保連接緊密，無泄漏。
?平衡柱子：用適當(dāng)?shù)钠胶饩彌_液沖洗柱，以去除柱內(nèi)可能存在的雜質(zhì)和殘留的溶劑，使柱子達(dá)到穩(wěn)定的工作狀態(tài)。平衡緩沖液的流速和沖洗體積應(yīng)根據(jù)說明書進(jìn)行操作。
?上樣操作：將預(yù)處理后的樣品溶液緩慢注入柱中，控制上樣流速，使樣品能夠均勻地通過柱子，與抗體充分接觸。上樣量應(yīng)根據(jù)容量和目標(biāo)抗原的濃度進(jìn)行合理調(diào)整，避免過載導(dǎo)致分離效果下降。
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?洗滌緩沖液沖洗：上樣完成后，用洗滌緩沖液沖洗免疫親和柱，以去除未結(jié)合的非特異性物質(zhì)。洗滌緩沖液的流速和沖洗體積應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求進(jìn)行優(yōu)化，一般采用較低的流速和適當(dāng)?shù)臎_洗體積，以確保非特異性物質(zhì)能夠被充分洗脫，同時(shí)又不影響目標(biāo)抗原與抗體的結(jié)合。
?檢測(cè)洗滌效果：可以通過檢測(cè)洗滌流出液中的目標(biāo)抗原含量來評(píng)估洗滌效果。
（四）洗脫
?選擇合適的洗脫液：根據(jù)目標(biāo)抗原與抗體的結(jié)合特性，選擇合適的洗脫液。洗脫液應(yīng)能夠破壞抗原-抗體之間的結(jié)合力，使目標(biāo)抗原從抗體上解離下來。常用的洗脫液包括酸性緩沖液、有機(jī)溶劑等。
?洗脫操作：將洗脫液緩慢注入親和柱中，控制洗脫流速和洗脫體積。洗脫過程中，目標(biāo)抗原會(huì)隨著洗脫液流出柱子，收集洗脫液即可得到富集和純化的目標(biāo)抗原。洗脫流速一般較慢，以保證目標(biāo)抗原能夠充分洗脫下來，同時(shí)避免洗脫峰展寬。
（五）后續(xù)處理與分析
?濃縮與保存：收集到的洗脫液可能含有少量的雜質(zhì)和溶劑，需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)臐饪s處理，以提高目標(biāo)抗原的濃度。濃縮方法可以采用冷凍干燥、超濾等。濃縮后的目標(biāo)抗原應(yīng)妥善保存，避免其降解或失活。
?分析檢測(cè)：將富集和純化的目標(biāo)抗原用于后續(xù)的分析檢測(cè)，以確定目標(biāo)抗原的含量、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)等信息。
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